小鼠皮肤切创愈合过程中iNOS和eNOS表达的免疫组织化学研究

学研究

赵锐;官大威;路斌;韩阳;侯震寰;吴旭;张国华;李如波;胡更奕

【摘 要】目的观察小鼠皮肤切创愈合过程中,iNOS和eNOS在损伤区及损伤周边区内的表达及其变化规律.方法小鼠背部制作全层切创,应用免疫组织化学技术观察伤后切创组织中iNOS和eNOS的表达,并和无切创的小鼠作为对照.结果损伤区及损伤周边区细胞,伤后3 h的损伤皮肤组织中可见少量的多型核细胞表达iNOS和eNOS,伤后6～24h,大部分浸润的中性粒细胞和单核细胞为iNOS和eNOS阳性.随着时间的延长,iNOS和eNOS阳性细胞以单核细胞和成纤维细胞为主.伤后3hiNOS的阳性细胞比率较低,6h～1 d持续性增加并于1 d达到最高峰,3～7d维持在一个相对稳定的水平直至伤后10d再次达高峰,10～14d开始下降.eNOS的阳性细胞率在伤后1～3 h表达较低,6h～3 d持续性增高,并在3 d达到最高峰,在其后的5 d内保持稳定表达,之后开始下降.而且损伤区及损伤周边区、特别是肉芽组织内的新生血管可见iNOS和eNOS不同强度的表达.结论小鼠皮肤切创愈合过程中,iNOS和eNOS在损伤周边区内多型核细胞、单核细胞和成纤维细胞中表达,其时序性变化可望用于皮肤损伤时间的推断. 【期刊名称】《法医学杂志》 【年(卷),期】2005(021)003 【总页数】5页(P161-164,封三)

【关键词】皮肤;损伤愈合;损伤时间推断;iNOS;eNOS;免疫组织化学 【作 者】赵锐;官大威;路斌;韩阳;侯震寰;吴旭;张国华;李如波;胡更奕

【作者单位】中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁,沈阳,110001 【正文语种】中 文 【中图分类】DF795.1

皮肤损伤愈合是机体保持组织完整性而产生的一个有组织的、连续而复杂的过程，大致分为三个阶段，即炎症期、纤维增生期和组织重建期，有多种炎症细胞和生物化学介质参与皮肤损伤愈合的全过程，从而清除损伤、坏死的皮肤组织和入侵的病原体并重建损伤组织。

NO是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）合成的一种弥漫性的细胞内信号分子，具有广泛的生物学作用，包括血管舒张、抗微生物、抗肿瘤活性、免疫调节和神经递质功能[1,2]。研究表明在皮肤损伤愈合过程中NO发挥重要作用。本实验应用免疫组织化学染色技术对皮肤切创愈合过程中产生NO的两种关键酶诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS,iNOS）和内皮型一氧化氮合酶

(endothelial NOS,eNOS）的表达情况进行了研究，以推断NOS在皮肤损伤愈合过程中的生物学功能，并对NOS在皮肤损伤愈合过程中随时间表达的变化特点在推断损伤时间中的可应用性进行了探讨。 1.1 皮肤切创模型的制作和分组

健康成年清洁级昆明系小鼠36只，雌雄不限，体质量35～40g，随机分为12组，

每组3只，其中1组为正常对照组。1%戊巴比妥钠30mg·kg-1剂量腹腔麻醉，剪毛处理，常规手术消毒，在背部中央做一纵行长1.5cm皮肤全层切口。创面自然止血，不包扎，不施药。切创后每只小鼠分笼饲养，给予消毒饲料及蒸馏水并保持伤口干燥、防止伤口感染。分别于伤后0,1,3,6,12h 和1,3,5,7,10,14d将小鼠脱颈椎处死，取伤口处1.0cm× 1.5cm皮肤组织，对照组小鼠同样方法处理后不作切口，处死后取与损伤组小鼠相同部位大小相等的皮肤组织作为对照，所取皮肤标本放入4%多聚甲醛／PBS中固定24h后，脱水、透明、石蜡包埋。 1.2 免疫组织化学染色

制作5μm石蜡切片，贴敷于涂有APES的玻璃载片上。微波热修复法修复抗原(10mmol·L-1，pH6.0柠檬酸缓冲液)，正常羊非免疫血清孵育。兔抗iNOS （Neomarker）、eNOS（SantaCruz）作为一抗，按SP法免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）说明进行染色，DAB显色，苏木素核复染，染色中以PBS代替一抗作为阴性对照，未见非特异性染色。另做常规HE染色。 1.3 阳性细胞计数分析

400 倍显微镜下在每张切片中损伤区及损伤周边区内随机选取10个视野，计数包括中性粒细胞、单核细胞及成纤维细胞，计算每个视野中阳性细胞数与这三种细胞总数的比值，应用SPSS 11.0 for windows统计软件，采用单因素方差分析方法进行统计学处理，数据以±s表示。 2.1 HE染色

伤后1～3 h见真皮内毛细血管扩张、充血，毛囊周围开始出现少量中性粒细胞，6h可见创缘周围有部分上皮细胞均质化，细胞核消失，真皮内可见中性粒细胞浸润增多；12h皮下组织内可见大量渗出的中性粒细胞及单核细胞；1d创缘皮肤干燥并结痂，但创缘周围有大量的炎性细胞浸润，以单核细胞为主；3d伤口两侧的表皮在血痂下愈合，肉芽组织开始形成，成纤维细胞开始增生；5d增生的肉芽组

织从深筋膜呈楔型向创口内生长；7d伤口均被新生表皮覆盖，肉芽组织内可见较多的长梭行的毛细血管内皮细胞，增生细胞以成纤维细胞为主；10～14d，创口基本愈合，损伤区及损伤周边区内的中性粒细胞、单核巨噬细胞和成纤维细胞数量显著减少，细胞间质成分开始增多，肉芽组织向瘢痕组织转变。 2.2 损伤区及周边区iNOS的表达 2.2.1 对照组

对照组中iNOS只表达在表皮层、毛囊、皮脂腺。血管内皮细胞在正常皮肤中未见染色。 2.2.2 损伤组

伤后0h组切片染色与对照组染色基本相同，1～3h组损伤周边区开始有中性粒细胞的浸润，可见中性粒细胞中iNOS表达，但染色强度较淡；伤后6～12h，损伤周边区浸润的细胞数量增多，真皮层血管和毛囊周围可见散在阳性表达的单核细胞和中性粒细胞，其中大部分中性粒细胞着色；1d组损伤周边区表皮层、皮脂腺染色增强，真皮层基质内炎性细胞大部分呈阳性染色，以单核细胞为主，大部分中性粒细胞和成纤维细胞也呈阳性表达（图1，见封三）；伤后3d组，新生表皮的阳性染色强度增强，阳性细胞以单核细胞和成纤维细胞为主，此时组织间的中性粒细胞基本不表达i-NOS；3～7d组织细胞中iNOS的表达维持在一个相对稳定的水平，阳性细胞以成纤维细胞为主（图2，见封三）；伤后5d开始新生上皮染色强度减低，肉芽组织内新生血管内皮可见阳性染色。10d肉芽组织中阳性细胞数增加，可见大部分成纤维细胞阳性染色（图3，见封三）；14 d，肉芽组织萎缩，肉芽组织中新生血管的内皮细胞染色变浅，阳性表达细胞以成纤维细胞为主。 2.3 损伤区及周边区eNOS的表达 2.3.1 对照组

对照组中表皮层、毛囊、血管内皮及真皮皮脂腺eNOS呈阳性染色，其中表皮层

和血管内皮细胞染色均较淡（图4，见封三）。 2.3.2 损伤组

伤后0h组，切片染色与对照组基本相同；1h～3h组可见表皮下毛细血管内皮全部染色，并可见部分中性粒细胞阳性染色；6h～3d组，损伤周边区表皮层细胞和表皮下、真皮内血管内皮细胞阳性染色逐渐增强，其中可见有部分多形核白细胞、单核细胞和成纤维细胞阳性染色（图5，见封三）；5～10 d新生表皮及周边区表皮染色强度开始下降，在新生的肉芽组织内，新生血管内皮细胞均表达eNOS，并且染色较3 d增强，肉芽组织内的阳性细胞以单核巨噬细胞和成纤维细胞为主，且基本保持在稳定的表达水平；伤后10 d～14d组可见新生上皮的阳性染色较周围组织的血管内皮深，肉芽组织中的阳性染色细胞主要是血管内皮细胞为主，可见少量的成纤维细胞阳性染色（图6，见封三）。 2.4 阳性细胞计数和统计学分析

表1为iNOS、eNOS阳性细胞百分率，经统计学方差分析，各相邻两组之间iNOS、eNOS阳性细胞比率相比有显著性差异（P＜0．01）。其中伤后1 d和10 d iNOS阳性细胞百分率与其他各时间组相比均有显著性差别（P＜0．01）。伤后3deNOS阳性细胞百分率与其他各时间组相比有显著性差别（P＜0．01）。 NOS即一氧化氮合酶，有三种亚型，是由不同染色体上的不同基因编码的，分为结构型NOS（constitutive NOS,cNOS）和诱导型NOS。前者又可分为神经型NOS（neuronal NOS，nNOS）和内皮型NOS，NOS均为由两个相同亚基组成的二聚体。cNOS基因的翻译产物均为无活性的单体。cNOS单体生成后与Ca2+或钙调蛋白（calmodulin，CaM）复合体结合，再与血红素、四氢生物喋呤结合形成二聚体，而iNOS是以单体形式或在无Ca2+的条件下与CaM复合体结合形成二聚体而发挥其生物学活性的。

近来的研究表明，NO在皮肤损伤愈合过程中炎症介导、细胞增殖、分化、凋亡及

血管形成、基质沉积和损伤后组织重构中发挥重要作用。因此皮肤切创愈合过程中，组织细胞中产生NO的两种关键酶iNOS 和eNOS的动态表达，可间接反映组织中NO的生成量及其发挥的生物学作用。另外，在iNOS[3]和eNOS[4]基因敲除的小鼠中损伤愈合的时间明显延长，说明NOS同工酶在损伤愈合过程中发挥重要作用。因此研究皮肤损伤愈合过程中iNOS和eNOS在不同部位和细胞中的动态表达会进一步表明NO在损伤愈合过程中的重要作用。

本实验应用免疫组织化学染色技术观察到在小鼠皮肤切创愈合过程中，皮肤损伤区及损伤周边区内的中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞有NOS亚型的表达，而且表皮层细胞、血管内皮细胞也有iNOS和eNOS的动态表达，表明两者参与皮肤损伤愈合的全过程。正常皮肤中表皮层、毛囊、皮脂腺有iNOS的表达，而且表皮层、毛囊、真皮皮脂腺及血管内皮细胞还有eNOS的表达，这可能与皮肤应对外界环境的变化和皮下血流量的调节等作用相关。

研究表明炎症细胞表达的iNOS受早期炎症细胞因子刺激而激活，并产生大量的NO参与皮下免疫反应的早期炎症过程[1]，并且早期iNOS的高水平表达可以产生大量的NO，从而与中性粒细胞和巨噬细胞产生的氧自由基结合，减低组织损伤[2]。本实验结果发现损伤愈合的早期3h～3d真皮层内浸润的全部单核巨噬细胞和部分多形核白细胞、成纤维细胞表达iNOS，并且阳性细胞率在1d达到高峰。而eNOS在伤后3h～3d除在表皮层和皮下、真皮内的毛细血管内皮表达外，损伤区及损伤周边区浸润的单核细胞、增生的成纤维细胞也有阳性表达，这与Reichner等的研究结果相同，即早期损伤周边区的cNOS低水平表达可能在调节愈合创口的血流量有重要作用，并直接影响愈合的过程[5]。另外，伤后5～7d，单个核细胞表达iNOS水平下降并维持在一个相对稳定的低水平，在此阶段eNOS的表达水平也相对稳定，可见肉芽组织中成纤维细胞、单核细胞表达eNOS，这可能是参与肉芽组织中细胞的增殖、迁移和新血管的形成，并为肉芽组织的生长和

新上皮的再生提供足够的营养和机体内环境。损伤愈合的最后阶段就是胶原的合成和沉积，大多数研究表明通过刺激iNOS的表达有利于创伤中胶原的增加，创伤源性的成纤维细胞在应用NOS抑制剂后胶原合成下降[6]。伤后10d损伤周边区可见iNOS表达的第二高峰，提示很可能是iNOS产生的大量NO在损伤区的胶原沉积中发挥重要作用。另外还有研究表明，过量的NO对胶原合成有抑制作用，在损伤愈合的晚期需要NOS活性下降而精氨酸酶活性增强从而促进胶原的形成[7]。本实验研究表明10～14dNOS亚型活性开始下降，但仍高于正常水平，也进一步说明了损伤愈合晚期，低水平表达的NOS产生少量的NO，使精氨酸酶获得足量的L—精氨酸底物，分解成羟脯氨酸并进一步增加胶原的合成[7]；但精氨酸酶促进胶原合成的过程是NOS依赖性的，这种低水平表达的NOS活性对胶原的合成是必不可少的[8]；这些充分表明了愈合创口中iNOS和eNOS的持续性不同水平的表达对胶原的堆积并增加创口张力均有重要的作用。

值得提出的是本实验通过对各时间段iNOS和eNOS表达的阳性细胞率进行统计学分析还发现NOS表达的阳性细胞比率随损伤后时间的不同而表现出规律性变化。iNOS的阳性细胞比率在伤后3h较低，6h～1d持续性增加并于1d达到最高峰，3～7d维持在一个相对稳定的水平直至伤后10d再次达高峰，10～14d开始下降。eNOS的阳性细胞率在伤后1～3h表达较低，6h～3d持续性增高，并在3d达到最高峰，在其后的5d内保持稳定表达，直至伤后10d开始下降，14d达到最低点，提示iNOS和eNOS随皮肤伤后时间不同呈现出规律性变化，可作为推断皮肤损伤时间的指标。

本实验的研究结果提示NOS作为皮肤损伤愈合过程中合成NO的关键酶，在皮肤损伤愈合过程中各期均发挥重要的作用，是皮肤损伤愈合过程中的重要因子。同时，在皮肤损伤愈合过程中iNOS和eNOS表达的时间规律性变化可望作为一种客观

指标用于皮肤损伤时间的推断。

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